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探討microRNA-195在老化相關之大腦功能退化中的角色= The ...

陳建元

探討microRNA-195在老化相關之大腦功能退化中的角色= The Role of MicroRNA-195 in Aging-associated Brain Dysfunctions/

Record Type:	Language materials, printed : Monograph/item
Title/Author:	探討microRNA-195在老化相關之大腦功能退化中的角色= / 陳建元
Reminder of title:	The Role of MicroRNA-195 in Aging-associated Brain Dysfunctions/
remainder title:	The Role of MicroRNA-195 in Aging-associated Brain Dysfunctions
Author:	陳建元
Published:	[高雄市]: [撰者], : 民113,
Description:	184葉 :圖 ; : 30公分;
Notes:	指導教授: 卓夙航, 陳正生.
基督教聖經之智慧書導讀 :	背景：由於全球老年人口的不斷增加，認知衰退的診斷和治療在全球公共衛生上顯得日益重要。從之前的研究中，我們發現microRNA-195 (miR-195) 在大腦中含量高於其他器官，且我們也發現miR-195具有保護血管、抗發炎和神經保護的效果。過去的研究指出，血腦屏障 (blood-brain barrier) 的破壞與神經退化性疾病的發生有高度關聯。基於上述發現，本研究假設miR-195在大腦老化過程中對於維持血腦屏障的完整性和神經功能上扮演了關鍵角色。在我們的第一項研究中，我們探討星形膠細胞 (astrocyte) 和大腦內皮細胞 (endothelial cell) 之間的交互作用，並找出miR-195調節的外泌體 (exosome) 蛋白質和血腦屏障的緊密連接 (tight junction) 蛋白的代謝間的因果關係，以及這些外泌體蛋白導致血腦屏障滲漏的機轉。在第二項研究中，基於我們之前在中風 (stroke) 領域的研究發現miR-195通過抑制Semaphorin 3A (Sema3A) 提供神經保護作用，因此我們旨在探索miR-195及miR-195調節的Semaphorin 3家族成員在與年齡相關的失智症中的角色，並為腦部老化引起的失智症找到早期診斷的生物標記與新的藥物標靶。方法：在我們的第一項研究中，我們使用q-RT-PCR測量小鼠的腦部 miR-195水平。運用MRI技術、 Evans Blue 滲透試驗，以及組織病理染色，我們評估了 miR-195基因剔除鼠血腦屏障 (BBB) 的滲漏情況。進一步利用FITC-dextran透性試驗和 Western blotting 研究星形膠細胞 (astrocyte) 外泌體 (exosome) 對血腦屏障完整性的影響。通過 iTRAQ 蛋白質分析法，篩選出 miR-195 調控的thrombospondin-1 (TSP1) 可能在血腦屏障滲漏中扮演關鍵作用。為了探討TSP1如何破壞血腦屏障，我們使用proximity ligation assay (PLA) 和co-immunoprecipitation (co-IP) 探究 TSP1是否經由調控緊密連接 (tight junction) 蛋白的選擇性自噬 (selective autophagy) 破壞血腦屏障。此外，為了評估 TSP1 作為血腦屏障滲漏的生物標記的可行性，我們使用ELISA比較患有腦部小血管疾病 (small vessel disease, SVD) 的患者與控制組的血清 TSP1 水平。在我們的第二項研究中，我們使用miR-195基因剔除鼠探討 miR-195 對衰老和認知功能的影響。先運用 TargetScan 預測 Sema3D 為 miR-195 的標靶基因，再通過螢光酶基因試驗 (luciferase reporter assay) 確認其因果關係。我們使用beta-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)染色和樹突脊刺密度 (dendritic spine density) 評估 Sema3D 和 miR-195 對小鼠神經衰老的影響。為進一步研究 Sema3D 在認知功能中的作用，我們使用Sema3D高度表現的病毒 (lentivirus) 或 si-RNA調控小鼠腦部的Sema3D表現。隨後使用水迷宮測試(Morris Water Maze)、Y形迷宮(Y-maze)和開放場測試(open field tests)來評估Sema3D對認知功能的影響。此外，我們運用表現Sema3D同源基因的果蠅為模型探討 Sema3D 對壽命的影響。最後為了測試 Sema3D 是否能成為一個治療標的，我們以同源建模(homology modeling)和虛擬篩選技術(virtual screening techniques) 開發 Sema3D 抑制劑。結果：在第一項研究中，我們證明了大腦內 miR-195 隨著年齡的增加而減少，也在 miR-195基因剔除鼠發現血腦屏障滲漏增加。miR-195高度表現的星形膠細胞的外泌體 (exosome) 增加大腦內皮細胞的緊密連接蛋白表現，從而改善了血腦屏障的滲漏。為了探索 miR-195增加緊密連接蛋白的機制，我們應用了iTRAQ蛋白質體學方法分析外泌體蛋白，結果顯示 miR-195 調控的TSP1可能是導致血腦屏障破壞的主要因子。我們在細胞和動物研究中證實 TSP1導致血腦屏障滲漏的因果關係。實驗結果證實，透過靜脈或直接腦內注射TSP1抗體給小鼠，可以逆轉血腦屏障 (BBB) 的滲漏情況。鑒於miR-195可抑制TSP1，我們也證明了注射 miR-195 可以挽救 TSP1導致的血腦屏障破壞。在臨床情境中，人類的腦小血管疾病 (small vessel disease, SVD) 與血腦屏障的滲漏有關。我們測試了血清中的 TSP1 是否可作為血腦屏障滲漏的生物標記，結果顯示 SVD 患者的血清 TSP1 水平比起控制組明顯較高。在機轉上，我們不僅發現 TSP1抑制大腦內皮細胞的一般自噬作用，更證明了 TSP1透過增加 Claudin5-p62和ZO1-p62 複合體生成，導致緊密連接蛋白的選擇性自噬 (selective autophagy) 導致血腦屏障的破壞。在第二項研究中，我們首先於miR-195基因剔除鼠觀察到顯著的認知功能退化和樹突脊突密度 (dendritic spine density) 降低。我們驗證了Sema3D為 miR-195 的標靶基因，並可能是導致老化相關的神經退化的原因。另外，Sema3D在小鼠的大腦中的表現隨年齡增加。我們將Sema3D高度表現的病毒(lentivirus) 注入小鼠的海馬迴會導致顯著的記憶力損傷。抑制海馬迴的Sema3D可以改善miR-195基因剔除鼠的認知功能。此外，在10週內於小鼠大腦重複注射Sema3D高度表現的病毒，會導致記憶與認知功能隨著注射時程逐漸惡化。更重要的是，運用Gene Expression Omnibus數據庫提供的人類大腦基因分析結果顯示，失智症患者的Sema3D水平顯著高於正常對照組（p<0.001）。在果蠅的神經系統中高度表達Sema3D的同源基因會導致其運動活性下降和與壽命減少25%。從機制上看，Sema3D被發現降低神經幹細胞特性(stemness)和數量，同時也破壞神經元的自噬功能。將雷帕黴素 (Rapamycin) 送入小鼠大腦可逆轉Sema3D引起的認知障礙。我們設計合成的新型抑制Sema3D小分子顯著提升Sema3D共同培養的神經元(Sema3D-treated neurons) 的生存能力並增強其自噬效率，為Sema3D作為潛在的藥物標靶提供了初步的證據。結論：我們第一項研究證實 miR-195 在維持血腦屏障完整性中的重要角色。老化過程中大腦miR-195下降使其調控的 TSP1 增加，從而促進緊密連接蛋白的選擇性自噬作用，最終導致血腦屏障滲漏。在我們的第二項研究中，我們發現 miR-195 和 Sema3D 在與老化相關的神經退化的重要性。我們證實 Sema3D 可作為一個新的認知功能退化風險因子，為預防和治療神經退化性疾病提供了可能性。總體而言，我們的研究發現miR-195調控的TSP1與Sema3D在血腦屏障滲漏與神經退化的因果關係。這些新發現的機轉擴展了我們對於老化相關的認知功能障礙的理解，並為治療策略的開發提供新的思路。 .
Online resource:	電子資源
[NT 15000934]:	(精裝)

探討microRNA-195在老化相關之大腦功能退化中的角色= The Role of MicroRNA-195 in Aging-associated Brain Dysfunctions/
陳建元

探討microRNA-195在老化相關之大腦功能退化中的角色= The Role of MicroRNA-195 in Aging-associated Brain Dysfunctions/ The Role of MicroRNA-195 in Aging-associated Brain Dysfunctions陳建元 - [高雄市]: [撰者], 民113 - 184葉 :圖 ;30公分

指導教授: 卓夙航, 陳正生.

博士論文--高雄醫學大學醫學研究所博士班.

參考書目：葉.

致謝 2

背景：由於全球老年人口的不斷增加，認知衰退的診斷和治療在全球公共衛生上顯得日益重要。從之前的研究中，我們發現microRNA-195 (miR-195) 在大腦中含量高於其他器官，且我們也發現miR-195具有保護血管、抗發炎和神經保護的效果。過去的研究指出，血腦屏障 (blood-brain barrier) 的破壞與神經退化性疾病的發生有高度關聯。基於上述發現，本研究假設miR-195在大腦老化過程中對於維持血腦屏障的完整性和神經功能上扮演了關鍵角色。在我們的第一項研究中，我們探討星形膠細胞 (astrocyte) 和大腦內皮細胞 (endothelial cell) 之間的交互作用，並找出miR-195調節的外泌體 (exosome) 蛋白質和血腦屏障的緊密連接 (tight junction) 蛋白的代謝間的因果關係，以及這些外泌體蛋白導致血腦屏障滲漏的機轉。在第二項研究中，基於我們之前在中風 (stroke) 領域的研究發現miR-195通過抑制Semaphorin 3A (Sema3A) 提供神經保護作用，因此我們旨在探索miR-195及miR-195調節的Semaphorin 3家族成員在與年齡相關的失智症中的角色，並為腦部老化引起的失智症找到早期診斷的生物標記與新的藥物標靶。方法：在我們的第一項研究中，我們使用q-RT-PCR測量小鼠的腦部 miR-195水平。運用MRI技術、 Evans Blue 滲透試驗，以及組織病理染色，我們評估了 miR-195基因剔除鼠血腦屏障 (BBB) 的滲漏情況。進一步利用FITC-dextran透性試驗和 Western blotting 研究星形膠細胞 (astrocyte) 外泌體 (exosome) 對血腦屏障完整性的影響。通過 iTRAQ 蛋白質分析法，篩選出 miR-195 調控的thrombospondin-1 (TSP1) 可能在血腦屏障滲漏中扮演關鍵作用。為了探討TSP1如何破壞血腦屏障，我們使用proximity ligation assay (PLA) 和co-immunoprecipitation (co-IP) 探究 TSP1是否經由調控緊密連接 (tight junction) 蛋白的選擇性自噬 (selective autophagy) 破壞血腦屏障。此外，為了評估 TSP1 作為血腦屏障滲漏的生物標記的可行性，我們使用ELISA比較患有腦部小血管疾病 (small vessel disease, SVD) 的患者與控制組的血清 TSP1 水平。在我們的第二項研究中，我們使用miR-195基因剔除鼠探討 miR-195 對衰老和認知功能的影響。先運用 TargetScan 預測 Sema3D 為 miR-195 的標靶基因，再通過螢光酶基因試驗 (luciferase reporter assay) 確認其因果關係。我們使用beta-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)染色和樹突脊刺密度 (dendritic spine density) 評估 Sema3D 和 miR-195 對小鼠神經衰老的影響。為進一步研究 Sema3D 在認知功能中的作用，我們使用Sema3D高度表現的病毒 (lentivirus) 或 si-RNA調控小鼠腦部的Sema3D表現。隨後使用水迷宮測試(Morris Water Maze)、Y形迷宮(Y-maze)和開放場測試(open field tests)來評估Sema3D對認知功能的影響。此外，我們運用表現Sema3D同源基因的果蠅為模型探討 Sema3D 對壽命的影響。最後為了測試 Sema3D 是否能成為一個治療標的，我們以同源建模(homology modeling)和虛擬篩選技術(virtual screening techniques) 開發 Sema3D 抑制劑。結果：在第一項研究中，我們證明了大腦內 miR-195 隨著年齡的增加而減少，也在 miR-195基因剔除鼠發現血腦屏障滲漏增加。miR-195高度表現的星形膠細胞的外泌體 (exosome) 增加大腦內皮細胞的緊密連接蛋白表現，從而改善了血腦屏障的滲漏。為了探索 miR-195增加緊密連接蛋白的機制，我們應用了iTRAQ蛋白質體學方法分析外泌體蛋白，結果顯示 miR-195 調控的TSP1可能是導致血腦屏障破壞的主要因子。我們在細胞和動物研究中證實 TSP1導致血腦屏障滲漏的因果關係。實驗結果證實，透過靜脈或直接腦內注射TSP1抗體給小鼠，可以逆轉血腦屏障 (BBB) 的滲漏情況。鑒於miR-195可抑制TSP1，我們也證明了注射 miR-195 可以挽救 TSP1導致的血腦屏障破壞。在臨床情境中，人類的腦小血管疾病 (small vessel disease, SVD) 與血腦屏障的滲漏有關。我們測試了血清中的 TSP1 是否可作為血腦屏障滲漏的生物標記，結果顯示 SVD 患者的血清 TSP1 水平比起控制組明顯較高。在機轉上，我們不僅發現 TSP1抑制大腦內皮細胞的一般自噬作用，更證明了 TSP1透過增加 Claudin5-p62和ZO1-p62 複合體生成，導致緊密連接蛋白的選擇性自噬 (selective autophagy) 導致血腦屏障的破壞。在第二項研究中，我們首先於miR-195基因剔除鼠觀察到顯著的認知功能退化和樹突脊突密度 (dendritic spine density) 降低。我們驗證了Sema3D為 miR-195 的標靶基因，並可能是導致老化相關的神經退化的原因。另外，Sema3D在小鼠的大腦中的表現隨年齡增加。我們將Sema3D高度表現的病毒(lentivirus) 注入小鼠的海馬迴會導致顯著的記憶力損傷。抑制海馬迴的Sema3D可以改善miR-195基因剔除鼠的認知功能。此外，在10週內於小鼠大腦重複注射Sema3D高度表現的病毒，會導致記憶與認知功能隨著注射時程逐漸惡化。更重要的是，運用Gene Expression Omnibus數據庫提供的人類大腦基因分析結果顯示，失智症患者的Sema3D水平顯著高於正常對照組（p<0.001）。在果蠅的神經系統中高度表達Sema3D的同源基因會導致其運動活性下降和與壽命減少25%。從機制上看，Sema3D被發現降低神經幹細胞特性(stemness)和數量，同時也破壞神經元的自噬功能。將雷帕黴素 (Rapamycin) 送入小鼠大腦可逆轉Sema3D引起的認知障礙。我們設計合成的新型抑制Sema3D小分子顯著提升Sema3D共同培養的神經元(Sema3D-treated neurons) 的生存能力並增強其自噬效率，為Sema3D作為潛在的藥物標靶提供了初步的證據。結論：我們第一項研究證實 miR-195 在維持血腦屏障完整性中的重要角色。老化過程中大腦miR-195下降使其調控的 TSP1 增加，從而促進緊密連接蛋白的選擇性自噬作用，最終導致血腦屏障滲漏。在我們的第二項研究中，我們發現 miR-195 和 Sema3D 在與老化相關的神經退化的重要性。我們證實 Sema3D 可作為一個新的認知功能退化風險因子，為預防和治療神經退化性疾病提供了可能性。總體而言，我們的研究發現miR-195調控的TSP1與Sema3D在血腦屏障滲漏與神經退化的因果關係。這些新發現的機轉擴展了我們對於老化相關的認知功能障礙的理解，並為治療策略的開發提供新的思路。 .

(精裝)Subjects--Index Terms:

微小RNA

探討microRNA-195在老化相關之大腦功能退化中的角色= The Role of MicroRNA-195 in Aging-associated Brain Dysfunctions/
LDR:14193cam a2200229 i 4500 001 376916
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246 1 1 $a The Role of MicroRNA-195 in Aging-associated Brain Dysfunctions
260 # $a [高雄市]: $b [撰者], $c 民113
300 $a 184葉 : $b 圖 ; $c 30公分
500 $a 指導教授: 卓夙航, 陳正生.
500 $a 學年度: 112.
502 $a 博士論文--高雄醫學大學醫學研究所博士班.
504 $a 參考書目：葉.
505 0 # $a 致謝 2
520 3 $a 背景：由於全球老年人口的不斷增加，認知衰退的診斷和治療在全球公共衛生上顯得日益重要。從之前的研究中，我們發現microRNA-195 (miR-195) 在大腦中含量高於其他器官，且我們也發現miR-195具有保護血管、抗發炎和神經保護的效果。過去的研究指出，血腦屏障 (blood-brain barrier) 的破壞與神經退化性疾病的發生有高度關聯。基於上述發現，本研究假設miR-195在大腦老化過程中對於維持血腦屏障的完整性和神經功能上扮演了關鍵角色。在我們的第一項研究中，我們探討星形膠細胞 (astrocyte) 和大腦內皮細胞 (endothelial cell) 之間的交互作用，並找出miR-195調節的外泌體 (exosome) 蛋白質和血腦屏障的緊密連接 (tight junction) 蛋白的代謝間的因果關係，以及這些外泌體蛋白導致血腦屏障滲漏的機轉。在第二項研究中，基於我們之前在中風 (stroke) 領域的研究發現miR-195通過抑制Semaphorin 3A (Sema3A) 提供神經保護作用，因此我們旨在探索miR-195及miR-195調節的Semaphorin 3家族成員在與年齡相關的失智症中的角色，並為腦部老化引起的失智症找到早期診斷的生物標記與新的藥物標靶。方法：在我們的第一項研究中，我們使用q-RT-PCR測量小鼠的腦部 miR-195水平。運用MRI技術、 Evans Blue 滲透試驗，以及組織病理染色，我們評估了 miR-195基因剔除鼠血腦屏障 (BBB) 的滲漏情況。進一步利用FITC-dextran透性試驗和 Western blotting 研究星形膠細胞 (astrocyte) 外泌體 (exosome) 對血腦屏障完整性的影響。通過 iTRAQ 蛋白質分析法，篩選出 miR-195 調控的thrombospondin-1 (TSP1) 可能在血腦屏障滲漏中扮演關鍵作用。為了探討TSP1如何破壞血腦屏障，我們使用proximity ligation assay (PLA) 和co-immunoprecipitation (co-IP) 探究 TSP1是否經由調控緊密連接 (tight junction) 蛋白的選擇性自噬 (selective autophagy) 破壞血腦屏障。此外，為了評估 TSP1 作為血腦屏障滲漏的生物標記的可行性，我們使用ELISA比較患有腦部小血管疾病 (small vessel disease, SVD) 的患者與控制組的血清 TSP1 水平。在我們的第二項研究中，我們使用miR-195基因剔除鼠探討 miR-195 對衰老和認知功能的影響。先運用 TargetScan 預測 Sema3D 為 miR-195 的標靶基因，再通過螢光酶基因試驗 (luciferase reporter assay) 確認其因果關係。我們使用beta-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)染色和樹突脊刺密度 (dendritic spine density) 評估 Sema3D 和 miR-195 對小鼠神經衰老的影響。為進一步研究 Sema3D 在認知功能中的作用，我們使用Sema3D高度表現的病毒 (lentivirus) 或 si-RNA調控小鼠腦部的Sema3D表現。隨後使用水迷宮測試(Morris Water Maze)、Y形迷宮(Y-maze)和開放場測試(open field tests)來評估Sema3D對認知功能的影響。此外，我們運用表現Sema3D同源基因的果蠅為模型探討 Sema3D 對壽命的影響。最後為了測試 Sema3D 是否能成為一個治療標的，我們以同源建模(homology modeling)和虛擬篩選技術(virtual screening techniques) 開發 Sema3D 抑制劑。結果：在第一項研究中，我們證明了大腦內 miR-195 隨著年齡的增加而減少，也在 miR-195基因剔除鼠發現血腦屏障滲漏增加。miR-195高度表現的星形膠細胞的外泌體 (exosome) 增加大腦內皮細胞的緊密連接蛋白表現，從而改善了血腦屏障的滲漏。為了探索 miR-195增加緊密連接蛋白的機制，我們應用了iTRAQ蛋白質體學方法分析外泌體蛋白，結果顯示 miR-195 調控的TSP1可能是導致血腦屏障破壞的主要因子。我們在細胞和動物研究中證實 TSP1導致血腦屏障滲漏的因果關係。實驗結果證實，透過靜脈或直接腦內注射TSP1抗體給小鼠，可以逆轉血腦屏障 (BBB) 的滲漏情況。鑒於miR-195可抑制TSP1，我們也證明了注射 miR-195 可以挽救 TSP1導致的血腦屏障破壞。在臨床情境中，人類的腦小血管疾病 (small vessel disease, SVD) 與血腦屏障的滲漏有關。我們測試了血清中的 TSP1 是否可作為血腦屏障滲漏的生物標記，結果顯示 SVD 患者的血清 TSP1 水平比起控制組明顯較高。在機轉上，我們不僅發現 TSP1抑制大腦內皮細胞的一般自噬作用，更證明了 TSP1透過增加 Claudin5-p62和ZO1-p62 複合體生成，導致緊密連接蛋白的選擇性自噬 (selective autophagy) 導致血腦屏障的破壞。在第二項研究中，我們首先於miR-195基因剔除鼠觀察到顯著的認知功能退化和樹突脊突密度 (dendritic spine density) 降低。我們驗證了Sema3D為 miR-195 的標靶基因，並可能是導致老化相關的神經退化的原因。另外，Sema3D在小鼠的大腦中的表現隨年齡增加。我們將Sema3D高度表現的病毒(lentivirus) 注入小鼠的海馬迴會導致顯著的記憶力損傷。抑制海馬迴的Sema3D可以改善miR-195基因剔除鼠的認知功能。此外，在10週內於小鼠大腦重複注射Sema3D高度表現的病毒，會導致記憶與認知功能隨著注射時程逐漸惡化。更重要的是，運用Gene Expression Omnibus數據庫提供的人類大腦基因分析結果顯示，失智症患者的Sema3D水平顯著高於正常對照組（p<0.001）。在果蠅的神經系統中高度表達Sema3D的同源基因會導致其運動活性下降和與壽命減少25%。從機制上看，Sema3D被發現降低神經幹細胞特性(stemness)和數量，同時也破壞神經元的自噬功能。將雷帕黴素 (Rapamycin) 送入小鼠大腦可逆轉Sema3D引起的認知障礙。我們設計合成的新型抑制Sema3D小分子顯著提升Sema3D共同培養的神經元(Sema3D-treated neurons) 的生存能力並增強其自噬效率，為Sema3D作為潛在的藥物標靶提供了初步的證據。結論：我們第一項研究證實 miR-195 在維持血腦屏障完整性中的重要角色。老化過程中大腦miR-195下降使其調控的 TSP1 增加，從而促進緊密連接蛋白的選擇性自噬作用，最終導致血腦屏障滲漏。在我們的第二項研究中，我們發現 miR-195 和 Sema3D 在與老化相關的神經退化的重要性。我們證實 Sema3D 可作為一個新的認知功能退化風險因子，為預防和治療神經退化性疾病提供了可能性。總體而言，我們的研究發現miR-195調控的TSP1與Sema3D在血腦屏障滲漏與神經退化的因果關係。這些新發現的機轉擴展了我們對於老化相關的認知功能障礙的理解，並為治療策略的開發提供新的思路。 .
520 3 $a Purpose: The growing elderly population worldwide underscores the importance of advancing the diagnosis and treatment of cognitive decline for global public health. Our research has revealed that microRNA-195 (miR-195) is more abundant in the brain, and exhibits vasculoprotective, anti-inflammatory, and neuroprotective properties. Moreover, previous studies have suggested that disruption of the blood-brain barrier (BBB) directly contributes to neurodegenerative diseases. Therefore, we proposed that miR-195 might play a crucial role in preserving the integrity of the BBB and neuronal functions in the aging brain. In our first study, we explored the interaction between astrocytes and endothelial cells to understand the relationship between miR-195-regulated exosomal proteins and tight junction (TJ) proteins' metabolism and their impact on BBB permeability. Building on our previous findings that miR-195 offers neuroprotection by inhibiting Semaphorin 3A (Sema3A) in stroke models, our second study focuses on the involvement of miR-195 and the Sema3 family in age-related dementia, aiming to discover new biomarkers and therapeutic targets for dementia induced by brain aging. Methods: In our first study, we utilized q-RT-PCR to quantify cerebral miR-195 levels in mice. MRI, Evans Blue extravasation and histopathology staining were conducted to evaluate BBB leakage in miR-195a KO mice. Effects of exosomes from miR-195-enriched astrocytes on BBB integrity were investigated using the FITC-dextran permeability assay and Western blotting. Through iTRAQ proteomic approach, we identified that miR-195-suppressed thrombospondin-1 (TSP1) plays a critical role in BBB disruption. To decipher the mechanism by which TSP1 induces BBB disruption, proximity ligation assay (PLA) and co-immunoprecipitation (co-IP) were utilized to explore whether TSP1 affects BBB integrity by activating selective autophagy of TJ proteins. Furthermore, to assess the potential of TSP1 as a biomarker for BBB leakage, we used ELISA to measure serum TSP1 levels in patients diagnosed with cerebral small vessel disease (SVD). In our subsequent study, miR-195a KO mice were used to investigate miR-195's effects on aging and cognitive functions. TargetScan predicted Sema3D as a potential miR-195 target, which was validated via a luciferase reporter assay. The impact of Sema3D and miR-195 on neural senescence was evaluated using beta-galactosidase staining and dendritic spine density. To explore the role of Sema3D in cognitive functions, we modulated cerebral Sema3D expression via lentivirus-mediated overexpression and si-RNA-mediated suppression, followed by cognitive function assessment using Morris Water Maze, Y-maze, and open field tests. In addition, we explored the influence of Sema3D on the lifespan of Drosophila. To test whether Sema3D could be a therapeutic target, we developed a Sema3D inhibitor based on homology modeling and virtual screening techniques. Results: In the first study, we first demonstrated that cerebral miR-195 levels decline with age, correlating with increased BBB leakage in miR-195 knockout mice. Notably, exosomes from miR-195-enriched astrocytes increased endothelial TJ proteins, thereby improving BBB integrity. Proteomic analysis of exosomal proteins identified miR-195-regulated thrombospondin-1 (TSP1) as a significant factor in BBB disruption, supported by both cellular and animal models. Administration of TSP1 antibodies in mice led to a dose-dependent reversal of BBB leakage. Since miR-195 suppressed TSP1 levels, we also demonstrated that injection of miR-195 rescued TSP1-induced BBB leakage. In a clinical context, cerebral small vessel disease (SVD) is associated with BBB leakage in humans. We tested serum TSP1 as a biomarker, and the result showed that serum TSP1 levels were significantly higher in SVD patients. Mechanistically, we demonstrated that TSP1 activated selective autophagy of TJ proteins by increasing Claudin5-p62 and ZO1-p62 complexes. Additionally, TSP1 was found to inhibit general autophagy in cerebral endothelial cells. In our subsequent research, we observed cognitive impairments and reduced dendritic spine density in miR-195 knockout (KO) mice. Sema3D was identified as a direct target of miR-195, implicated in aging-related neurodegeneration. Elevated Sema3D levels were found in aging rodent brains, and its overexpression led to memory deficits. Conversely, suppressing Sema3D in the hippocampus improved cognitive function in miR-195 KO mice. Continuous administration of this lentivirus to increase brain Sema3D over a span of 10 weeks highlighted a progressive decline in operational memory. Analysis from the Gene Expression Omnibus database showed higher Sema3D levels in dementia patients compared to healthy counterparts (p<0.001). Increased expression of the Sema3D gene analogous in Drosophila's nervous system resulted in locomotor activity impairment and a 25% reduction in lifespan. Mechanistically, Sema3D compromised the stemness and number of neural stem cells and interfered with neuronal autophagy processes. Administration of rapamycin mitigated the cognitive disturbances induced by Sema3D. Our newly identified compound enhanced the health of neurons exposed to Sema3D and increased the efficiency of autophagy, highlighting the therapeutic potential of targeting Sema3D. Conclusions: The results of our first study underscore the critical role of miR-195 in preserving the integrity of the blood-brain barrier (BBB). We elucidated the intricate mechanisms through which miR-195-regulated thrombospondin-1 (TSP1) contributes to the breakdown of tight junction (TJ) proteins, thereby enhancing the selectivity of autophagy and leading to BBB leakage. In our subsequent study, we highlighted the importance of both miR-195 and Sema3D in the context of age-related neurodegeneration. We identified Sema3D as a novel risk factor, offering new insights into potential preventive and therapeutic approaches for neurodegenerative conditions. Together, our research illuminates the pivotal roles of miR-195 in maintaining BBB integrity through its interaction with TSP1, as well as the impact of miR-195 and Sema3D on age-related neurodegeneration. These insights advance our understanding of the mechanisms underlying age-related cerebral dysfunction and pave the way for the development of therapeutic strategies to protect both cerebrovascular and neurological health..
563 $a (精裝)
653 # # $a 微小RNA $a 神經退化 $a 老化.
653 # # $a microRNA $a Thrombospondin-1 $a Semaphorin3D $a Neurodegeneration $a Aging.
856 7 # $u https://handle.ncl.edu.tw/11296/q96cbc $z 電子資源 $2 http