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利用蛋白質工程使3α-羥基固醇去氫酶/羰基還原酶的天然輔酶特異性NAD轉換為NMN= Protein Engineering of Ct. 3α-HSD/CR for Switching the Natural Cofactor Specificity of NAD Into NMN/

Record Type:	Language materials, printed : Monograph/item
Title/Author:	利用蛋白質工程使3α-羥基固醇去氫酶/羰基還原酶的天然輔酶特異性NAD轉換為NMN= / 陳彥良
Reminder of title:	Protein Engineering of Ct. 3α-HSD/CR for Switching the Natural Cofactor Specificity of NAD Into NMN/
remainder title:	Protein Engineering of Ct. 3α-HSD/CR for Switching the Natural Cofactor Specificity of NAD Into NMN
Author:	陳彥良
Published:	[高雄市]: [撰者], : 民111,
Description:	105葉: 圖; : 30公分;
Notes:	指導教授: 黃啟清.
基督教聖經之智慧書導讀 :	利用生化反應進行工業品的生產通常需要使用細胞輔酶，例如NAD或NADP。輔酶工程能透過變造酵素的輔酶特異性以此調控生物體內的代謝路徑。價格低廉的NMN (nicotinamide mononucleotide)因為化學性質相較NAD(P)穩定，被認為是合適的輔酶來進行輔酶工程。Ct.3α-HSD/CR能夠進行立體特異性的催化反應，透過NAD將androsterone 轉換成androstandione和NADH。然而，3α-HSD/CR 對NMN的活性很差，為了使3α-HSD/CR的天然輔酶特異性從NAD轉換為NMN，我們選擇一些NAD周遭的位點進行突變。NAD包括NMN與AMP兩個部分，選擇NMN附近的殘基(T11、I13、A70與I112)突變成帶正電胺基酸(lysine和arginine)來與NMN的帶負電的磷酸根形成靜電作用。選擇AMP周遭的殘基(A70與D41)突變成側鏈較大的胺基酸(isoleucine 與 glutamine)，以此破壞NAD的結合。殘基(T11、I13、D41、I112)突變成alanine，擴大輔酶結合區以增加對於輔酶構型的靈活性。利用這些策略設計引子並進行定點突變，轉型進入E.coli BL21(DH3)進行重組3α-HSD/CR 的表達與純化，並成功獲得這些突變(T11A/K/R、I13A/K/R、D41A/I/Q、A70I/Q/K和I112A/K )。大量表現I13K、I13R、D41A、D41I、D41Q與A70I突變會造成包涵體的形成，造成產量銳減。我們使用低溫誘導I13R與D41Q突變能有效增加產率。在對NAD酵素動力學的結果中，T11位點的突變(T11A、T11K與T11R)與野生型3α-HSD/CR 的催化效率相似。然而其他突變會對催化效率造成3.6倍(I112A)到29000倍(I13R)的降低。其中A70I與A70Q突變會造成對NAD的催化效率大幅下降並對NMN的催化效率與野生型相似，A70K突變相比於野生型3α-HSD/CR對NMN的kcat/Km 增加8.7倍，而其輔酶特異性的比例更是上升9.6x10^4倍。A70K或許能透過靜電作用增加與NMN的影響並阻擋與NAD的結合。結構分析野生型與突變型3α-HSD/CR : 野生型與突變型3α-HSD/CR在內源性螢光相似，而D41I與D41Q會產生紅位移，表示內部結構改變。同時DSF的結果得知D41I與D41Q會降低熱穩定性，這些突變可能影響3α-HSD/CR 的結構。 Ct.3α-HSD/CR擁有Rossmann fold 來與輔酶結合，因此A70位點轉換成lysine或許能應用到其他Rossmann fold酵素。.
Online resource:	電子資源
[NT 15000934]:	(平裝)

利用蛋白質工程使3α-羥基固醇去氫酶/羰基還原酶的天然輔酶特異性NAD轉換為NMN= Protein Engineering of Ct. 3α-HSD/CR for Switching the Natural Cofactor Specificity of NAD Into NMN/
陳彥良

利用蛋白質工程使3α-羥基固醇去氫酶/羰基還原酶的天然輔酶特異性NAD轉換為NMN= Protein Engineering of Ct. 3α-HSD/CR for Switching the Natural Cofactor Specificity of NAD Into NMN/ Protein Engineering of Ct. 3α-HSD/CR for Switching the Natural Cofactor Specificity of NAD Into NMN陳彥良 - [高雄市]: [撰者], 民111 - 105葉: 圖; 30公分

指導教授: 黃啟清.

碩士論文--高雄醫學大學醫學研究所碩士班.

參考書目：葉.

中文摘要 1

利用生化反應進行工業品的生產通常需要使用細胞輔酶，例如NAD或NADP。輔酶工程能透過變造酵素的輔酶特異性以此調控生物體內的代謝路徑。價格低廉的NMN (nicotinamide mononucleotide)因為化學性質相較NAD(P)穩定，被認為是合適的輔酶來進行輔酶工程。Ct.3α-HSD/CR能夠進行立體特異性的催化反應，透過NAD將androsterone 轉換成androstandione和NADH。然而，3α-HSD/CR 對NMN的活性很差，為了使3α-HSD/CR的天然輔酶特異性從NAD轉換為NMN，我們選擇一些NAD周遭的位點進行突變。NAD包括NMN與AMP兩個部分，選擇NMN附近的殘基(T11、I13、A70與I112)突變成帶正電胺基酸(lysine和arginine)來與NMN的帶負電的磷酸根形成靜電作用。選擇AMP周遭的殘基(A70與D41)突變成側鏈較大的胺基酸(isoleucine 與 glutamine)，以此破壞NAD的結合。殘基(T11、I13、D41、I112)突變成alanine，擴大輔酶結合區以增加對於輔酶構型的靈活性。利用這些策略設計引子並進行定點突變，轉型進入E.coli BL21(DH3)進行重組3α-HSD/CR 的表達與純化，並成功獲得這些突變(T11A/K/R、I13A/K/R、D41A/I/Q、A70I/Q/K和I112A/K )。大量表現I13K、I13R、D41A、D41I、D41Q與A70I突變會造成包涵體的形成，造成產量銳減。我們使用低溫誘導I13R與D41Q突變能有效增加產率。在對NAD酵素動力學的結果中，T11位點的突變(T11A、T11K與T11R)與野生型3α-HSD/CR 的催化效率相似。然而其他突變會對催化效率造成3.6倍(I112A)到29000倍(I13R)的降低。其中A70I與A70Q突變會造成對NAD的催化效率大幅下降並對NMN的催化效率與野生型相似，A70K突變相比於野生型3α-HSD/CR對NMN的kcat/Km 增加8.7倍，而其輔酶特異性的比例更是上升9.6x10^4倍。A70K或許能透過靜電作用增加與NMN的影響並阻擋與NAD的結合。結構分析野生型與突變型3α-HSD/CR : 野生型與突變型3α-HSD/CR在內源性螢光相似，而D41I與D41Q會產生紅位移，表示內部結構改變。同時DSF的結果得知D41I與D41Q會降低熱穩定性，這些突變可能影響3α-HSD/CR 的結構。 Ct.3α-HSD/CR擁有Rossmann fold 來與輔酶結合，因此A70位點轉換成lysine或許能應用到其他Rossmann fold酵素。.

(平裝)Subjects--Index Terms:

非天然輔酶

利用蛋白質工程使3α-羥基固醇去氫酶/羰基還原酶的天然輔酶特異性NAD轉換為NMN= Protein Engineering of Ct. 3α-HSD/CR for Switching the Natural Cofactor Specificity of NAD Into NMN/
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500 $a 指導教授: 黃啟清.
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504 $a 參考書目：葉.
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520 3 $a 利用生化反應進行工業品的生產通常需要使用細胞輔酶，例如NAD或NADP。輔酶工程能透過變造酵素的輔酶特異性以此調控生物體內的代謝路徑。價格低廉的NMN (nicotinamide mononucleotide)因為化學性質相較NAD(P)穩定，被認為是合適的輔酶來進行輔酶工程。Ct.3α-HSD/CR能夠進行立體特異性的催化反應，透過NAD將androsterone 轉換成androstandione和NADH。然而，3α-HSD/CR 對NMN的活性很差，為了使3α-HSD/CR的天然輔酶特異性從NAD轉換為NMN，我們選擇一些NAD周遭的位點進行突變。NAD包括NMN與AMP兩個部分，選擇NMN附近的殘基(T11、I13、A70與I112)突變成帶正電胺基酸(lysine和arginine)來與NMN的帶負電的磷酸根形成靜電作用。選擇AMP周遭的殘基(A70與D41)突變成側鏈較大的胺基酸(isoleucine 與 glutamine)，以此破壞NAD的結合。殘基(T11、I13、D41、I112)突變成alanine，擴大輔酶結合區以增加對於輔酶構型的靈活性。利用這些策略設計引子並進行定點突變，轉型進入E.coli BL21(DH3)進行重組3α-HSD/CR 的表達與純化，並成功獲得這些突變(T11A/K/R、I13A/K/R、D41A/I/Q、A70I/Q/K和I112A/K )。大量表現I13K、I13R、D41A、D41I、D41Q與A70I突變會造成包涵體的形成，造成產量銳減。我們使用低溫誘導I13R與D41Q突變能有效增加產率。在對NAD酵素動力學的結果中，T11位點的突變(T11A、T11K與T11R)與野生型3α-HSD/CR 的催化效率相似。然而其他突變會對催化效率造成3.6倍(I112A)到29000倍(I13R)的降低。其中A70I與A70Q突變會造成對NAD的催化效率大幅下降並對NMN的催化效率與野生型相似，A70K突變相比於野生型3α-HSD/CR對NMN的kcat/Km 增加8.7倍，而其輔酶特異性的比例更是上升9.6x10^4倍。A70K或許能透過靜電作用增加與NMN的影響並阻擋與NAD的結合。結構分析野生型與突變型3α-HSD/CR : 野生型與突變型3α-HSD/CR在內源性螢光相似，而D41I與D41Q會產生紅位移，表示內部結構改變。同時DSF的結果得知D41I與D41Q會降低熱穩定性，這些突變可能影響3α-HSD/CR 的結構。 Ct.3α-HSD/CR擁有Rossmann fold 來與輔酶結合，因此A70位點轉換成lysine或許能應用到其他Rossmann fold酵素。.
520 3 $a Cofactor engineering is significant in the regulation of metabolic pathways by orthologous pathway. Lowering costs and greater stability make nicotinamide mononucleotide (NMN) a wonderful candidate for cofactor engineering. Ct.3α-HSD/CR catalyzes the stereospecific oxidoreductive reaction of NAD with androsterone to form NADH and androstanedione. However, 3α-HSD/CR acting on NMN shows a significant decrease in activity. To switch the cofactor specificity of NAD into NMN for Ct.3α-HSD/CR, we selected and mutated the residues close to NAD based on their interaction with NAD. Residues (T11, I13, A70 and I112) located around the NMN region of NAD were replaced into positive charge amino acids (lysine or arginine) in order to introduce more electrostatic interaction with the negatively charged phosphate on the NMN. Residues (D41 and A70) around AMP moiety of NAD were mutated to larger amino acids (glutamine and isoleucine). All the selected residues replaced into alanine to increase the conformational flexibility for NMN. Therefore, single mutations of T11A/K/R, I13A/K/R, D41A/I/Q, A70I/Q/K, and I112A/K variants of 3α-HSD/CR were prepared and purified in homogeneity. Expression of I13K, I13R, D41A, D41I, D41Q and A70I variants results in forming inclusion bodies. Use of low temperature during protein expression for I13R and D41Q mutants could increase the yield of purification. The catalytic efficiency of WT with NAD was similar to T11A, T11K and T11R variants 3α-HSD/CR but decreased in other variants from 3.6-fold for I112A mutant to 29000-fold for I13R mutant. Among these mutants, mutation on A70 showed a promising result in switching cofactor specificity of NAD into NMN. The catalytic efficiency for NAD significantly decreased with a concomitant increase for NMN. Kinetic study on A70K variant toward NMN showed a lower Km and a 17-fold increase in catalytic efficiency compared with WT. The cofactor specificity ratio of NMN and NAD for A70K and WT 3α-HSD/CRs was 4.4x10^-2 and 4.6x10^-7, respectively. A70K variant demonstrated a 105-fold increase in the relative cofactor specificity. Substitute lysine for A70 might enhance the electrostatic interaction with the phosphate group of NMN but block the binding site for NAD, resulting in a significant decrease for NAD but an increase for NMN in catalytic efficiency. In structural analysis of 3α-HSD/CR variants, variants of D41I and D41Q showed a red shift of the maximum wavelength by intrinsic protein fluorescence, indicating the changes of protein structure. Meanwhile, the thermal unfolding of D41I and D41Q mutants appeared lower thermodynamic stability. by differential scanning fluorimetry, suggesting the mutation caused the change of structure. Ct.3α-HSD/CR bind NAD with a conserved Rossmann fold. A70K mutant for Ct. 3α-HSD/CR might be useful to study other Rossmann fold enzymes. .
563 $a (平裝)
653 # # $a 非天然輔酶 $a 穩定狀態動力學 $a 酵素催化 $a 合理設計 $a 酵素工程 $a 蛋白質穩定性.
653 # # $a Biomimetic cofactor $a Rational design $a Steady-state kinetics $a Enzyme catalysis $a Protein engineering $a Protein stability.
856 7 # $u https://handle.ncl.edu.tw/11296/2y36u7 $z 電子資源 $2 http